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继续教育
中药质量标准评价方法研究进展
2007年北京地区药学年会
时间: 2015-11-25 14:47:00 作者:吴真

    摘  要 为了保证中药的安全性和有效性,中药一直处于不断标准化和规范化的进程中。2005版药典中,现代仪器分析有了大量的应用,从使用的各种分析方法看,高效液相色谱法占绝对优势,而且几乎呈直线上升的趋势。作为中药质量标准常规检验的分析技术在可预见的将来仍然是TLC、HPLC、GC占主导地位,但中药指纹图谱等新技术、新方法随着时代的发展和仪器的进步,也会逐步进人常规检验的层面。
    关键词 中药质量标准 评价方法 研究进展
 

    中药是中国医药学的伟大宝库,为了保证中药的安全性和有效性,中药一直处于不断标准化和规范化的进程中。新中国成立后,中国政府颁布了八版药典,收载的内容及品种都在逐渐增多,每个品种项下的“鉴别”、“含量测定”及“注意事项”等内容,都在随着时代的发展而不断地提高和完善。从分析鉴别手段上,20世纪50、60年代主要是“基源”、“外观性状”、“试管反应”,从1985年版《中国药典》开始,色谱、光谱技术在中药质量控制中开始被采用,到2005年版《中国药典》,现代仪器分析有了大量的应用,从使用的各种分析方法看,高效液相色谱法占绝对优势,而且几乎呈直线上升的趋势。各种方法的综合运用,使中药质量标准的评价不断创新发展完善。
 

    1 现行的中药质量标准
    现行的中药质量标准模式基本是沿着天然药物化学的发展,引发分析工作者建立以测定中药某一有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构想,参照国外植物药的质量控制方法,借鉴化学药品质量控制的模式,借助于文献报道选定某一中药的“有效成分”、“活性成分”、或“指标成分”,建立相应的理化鉴别,再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。随着历版《中国药典》的制订、修订、增订以及《药品注册管理办法》的实施,这种模式的中药分析方法和质量标准被大面积普及推广,并逐步提高和改进。半个世纪以来,这种模式的质量标准在中药材及中成药的生产、研究和上市药品的监督管理等方面,起着不可替代的重要作用[1]。
 

    2 中药质量标准中常用的分析方法
    2.1 显微鉴别 显微鉴别是经典的鉴别方法,它是利用显微镜对药材组织构造、细胞或内容物等特征进行鉴别。现阶段及今后一段时间,显微鉴别仍将在定性鉴别中占有较高比例。


    2.2 理化性质鉴别 理化性质鉴别是利用物理或化学分析方法鉴定分析中药中所含的主要化学成分,是利用药材中的化学成分与某些试剂发生特殊的颜色反应或沉淀反应的原理来进行鉴识。


    2.3 薄层色谱法 薄层色谱法不仅因为其具有简便、快速、专属、分离和分析等特点而被广泛应用,更因为该法相对于其它鉴别方法可以提供更多更准确的定性信息,甚至在中药所含成分不完全清楚、特征成分未知、或可能存在相互干扰且无对照物的情形下,可通过改变实验条件得到准确的定性信息。每味中药材除含有有效成分外,还含有大量的其它成分,由多味中药材组成的中成药,其成分就更加复杂,要在大量杂质(无关成分)存在下检出一种或多种成分,其难度之大是可想而知的,薄层色谱法成为当前中药材和中成药鉴别的首选方法。
 

    2.4 紫外-可见分光光度法 中药材或中成药中某些化学成分在特定波长处或一定波长范围内有选择性吸收,显示特征吸收光谱曲线。紫外-可见分光光度法是通过测定这些化学成分的吸光度对药材和制剂进行定量分析。


    2.5 气相色谱法 气相色谱法是以气体为流动相的分析方法,分离效能高、样品用量少、分析速度快、应用范围较广,尤其适合于含挥发性成分的中药鉴别和含量测定。另外,应用该方法选用不同的检测器[如氢火焰离子化检测器(FID)、电子俘获检测器(ECD)、热导检测器(TCD)],可进行农药残留测定、水分测定;采用顶空分析-气相色谱法,可直接对封闭系统中液体或固体样品相平衡的气体进行分析,它不仅可分析含量低的组分,也可分析组成复杂的混合物,因此除分析中药中挥发性成分外,还常用于样品的有机溶剂残留量分析。


    2.6 高效液相色谱法 HPLC是一种非常有效并普遍应用的中药分析方法,HPLC不像GC那样受样品挥发性和热稳定性的限制,可用于高分子、极性、离子和热不稳定化合物的分离分析,具有快速灵敏、精密度高、重现性好的优点,在中药的定性、定量和杂质检查等方面都发挥了重要作用。紫外检测器仅限于测定具有紫外吸收特征的成分,在中药检验中受到限制,但蒸发光散射检测器(ELSD)的应用弥补了紫外检测器的不足,ELSD是一种通用型的检测器,适用于所有非挥发性组分的检测,与HPLC联用,具有分离效率高、检测范围广的优势,大大拓宽了HPLC的应用范围,可用于测定中药中树脂、糖类、苷类、氨基酸、脂类及大分子有机酸等成分。
 

    3《中国药典》2005年版一部主要增修订情况
    《中国药典》1990年版,首次引用现代仪器检测方法测定含量,如HPLC、GC和TLCS等,本版药典有了更长足的进步。从使用的分析方法看,现代仪器分析方法得以大量的应用, 《中国药典》2005年版(一部)附录中收载的现代仪器分析技术主要有分光光度法和色谱法。分光光度法主要包括:紫外-可见分光光度法、红外分光光度法和原子吸收分光光度法。色谱法主要包括:薄层色谱法、柱色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和毛细管电泳法,其中毛细管电泳法于《中国药典》2000年版(一部)附录中收载,还没有具体品种应用的实例。就含量测定而言,药材及其饮片551个品种中,有281个建立了含量测定方法,其中采用HPLC等仪器分析方法的为217个,占总数的77%;植物油脂和提取物31个品种中,有22个建立了含量测定,采用HPLC等仪器分析方法的有17个,亦占总数的77%;成方制剂和单味制剂564个品种中,有438个建立了含量测定,采用HPLC等仪器分析方法的有412个,占总数的94%。从使用的各种分析方法看,HPLC占绝对的优势,而且几乎呈直线上升的趋势,由2000年版的105个,上升至2005年版的518个,TLCS则呈下降的趋势,由2000年版的60个,下降至2005年版的45个,GC法由2000年版的11个,上升至2005年版的37个。从这些数据可以看出,中药的质量标准有了大幅度的提高,大大增加了中药质量标准的科学性和可控性,同时还体现了实用性和可操作性[2]。
 

    4 中药质量标准检测新技术、新方法
    作为中药质量标准常规检验的分析技术在可预见的将来仍然是TLC、HPLC、GC占主导地位,但一些新技术、新方法随着时代的发展和仪器的进步,也会逐步进人常规检验的层面。
    4. 1超临界流体萃取超临界流体色谱(SFE-SFC )
    处于临界温度和临界压力以上状态的物质称为超临界物质,将其作为萃取剂称SFE,将其作流动相称为SFC,SFE-SFC是一种兼有提取、浓缩、分离和检测功能的二级分离分析方法。SFE具有省时、省力、取样量少、萃取率高、选择性可调等优点,特别适用于中药的预处理。SFC是介于GC和HPLC之间的一种色谱技术,具有HPLC和GC的优点,能分离分析难挥发、遇热不稳定、HPLC难检测的物质。而且,SFC已发展到联用技术,有SFC ( MS联用,SFC付氏变换红外光谱联用)等。


    4. 2高效毛细管电泳法(HPCE)
    高效毛细管电泳是20世纪80年代后期发展起来的分离分析技术,广泛用于蛋白质、氨基酸以及药物的分离分析。其原理是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间的电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术。它具有分析时间短、分离效率高(理论板数大于105 )、检测限低、进样量小、自动化程度高等优点。具有多种分离模式,包括毛细管区带电泳(CZE)、毛细管胶束电动色谱( MECC )、毛细管等速电泳(CI'I'P )、毛细管等电聚焦电泳(CIEF )、毛细管凝胶电泳(CGE)、有毛细管电色谱(CEC)和非水毛细管电泳(CNACE)等。在中药研究领域,主要采用CZE和MECC模式对生物碱、黄酮类、香豆素、有机酸和各种昔类成分进行分离分析,并取得了良好的效果。HPCE特别适用于结构相近的多肤蛋白的分析。


    4. 3分子生物学技术
    目前用于中药材鉴定的分子标记技术主要有两类,一类是DNA指纹图谱技术,主要是利用DNA分子酶切片段长度的多态性或DNA扩增片断长度的多态性来鉴别中药材RELP,APPCR,RAPD,AFLP,SSR等技术;另一类是DNA测序技术,选取特定的基因或DNA片断测序,根据对被测序DNA分子核昔酸序列多态性的分析在分子系统学的基础上鉴别中药材,目前应用较多的是ITS ,SS DNA基因。


    4.4光谱技术鉴别中药材
    目前,采用紫外光谱,包括一阶导数光谱,红外光谱、核磁共振氢谱以及X一衍射技术等鉴别中药材已有大量的研究。这些方法已经成为中药材鉴别的新方法。
    由袁久荣教授提出的紫外光谱谱线组指纹分析系统依据植物中化学成分的系统分离提取方法,利用4种典型的代表不同极性区间的溶剂:水、无水乙醇、氯仿、石油醚分别提取中药中的4个极性区间的成分,测试各自的紫外光谱,获得各吸收峰波长信息,用于系统鉴别各类植物中药材及复方。方法简便,可操作性强。
    利用傅里叶变换红外光谱、付里叶变换拉曼光谱进行中药质量控制近年来取得了一定的进展。对于一个混合物体系,则其分子光谱中峰位、峰形、峰强度则代表着体系中所含相应各种基团的谱峰的叠加,混合物组成的变化,将导致分子光谱整体谱图的变化,因此便构成谱图的宏观指纹性。利用这种宏观指纹性,可以直接地或者稍作数学处理进行中药的鉴定与质量控制。
    X一衍射技术在中药鉴别方面近年来比较活跃。单味药是由多种化学成分组成的,而每一种单一成分则对应着一幅专属的X一衍射图谱,因此,用X-衍射技术可再现中药材中全部成分的整体信息。采用X一衍射技术沿用材料学中的物相分析,通过峰的归属确定高含量的个别物质。用X一衍射对矿物类药材进行研究,利用衍射特征峰敏锐、指纹性强的
特点,可有效鉴别。


    4.5电感耦合等离子体质谱
    ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)是80年代初出现的将电感耦合等离子体( ICP)和质谱(MS)技术联合起来的一种新的分析技术,它提供了一个强有力的无机元素分析工具,进行元素的检测和同位素分析。它具有很多特点如(1)灵敏度高:ICP-MS仪器的灵敏度一般比ICP-AES法(电感耦合等离子体原子发射光谱法)高1~2个数量级,对多数元素检出限可达10-12~10-10g•L-1 (2)图谱简单:ICP-MS仪器产生的几乎完全是单电荷离子,测得的质谱图十分简单,一共只有201条,这一特性使得ICP-MS数据处理系统可储存更多的谱图,而且对样品处理系统来说,不需经化学分离可直接进行多元素的测定;(3)高分辨能力和分析精度:其分辨率为0. 4 mm。对同位素分析,其精度为0. 1%~1%;对元素分析,长周期元素的分析精度为3%~5%;短周期元素的分析精度为1%~3%;(4)分析元素范围宽、速度快:在元素周期表中,除碳、氢、氧等极少数元素外,绝大多数元素都能用ICP-MS仪进行测定。最新的仪器能在35 S内得出75种元素的信号强度。


    4.6色谱与光谱等联用技术
    色谱技术分离能力强、检测灵敏度高、分析速度快,是复杂混合物分析的首选技术。但是,色谱在对未知物定性方一面往往难于给出可靠信息。而光谱与波谱技术如质谱、红外光谱和核磁共振波谱等,具有很强的鉴定未知物结构的能力,却不具有分离能力,因而对复杂混合物无能为力。因此,将色谱与光谱或波谱联合使用,取长补短,已成为复杂混合物分析,尤其是定性分析的最重要的手段。目前,这类联用技术已十分普遍,其中报道较多用于中药制剂分析的方法有GC-MS, GC-FTIR, HPLC-MS, HPLC-NMR,CE-MS。


    4. 7色谱分析前处理新技术
    进行中药、中成药分析、药物制剂分析和生物样品中的药物分析时样品的制备尤其重要。色谱分析中样品预处理的主要作用有:(1)将待测定物质有效地从样品基质中释放出来,并制备成便于分析测定的稳定试样;(2)除去杂质,纯化样品;(3)富集浓缩样品或进行衍生化。样品的预处理技术多种多样,包括蒸发、浓缩、吸附、沉淀和过滤等传统技术,也包括新近发展起来的在线处理技术、超临界流体萃取、固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、电子鼻、电子舌等现代技术,还有化学衍生化技术。


    4. 8中药指纹图谱
    中药指纹图谱是一种创新型中药质量控制核心技术,它充分利用现代科学技术手段,完整地表征中药复杂体系特征性的检测方法。
    中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的,用以表征中药化学成分特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光谱(IR),色谱最常用的是薄层色谱( TLC )、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC )和毛细管电泳(CE)。中药生物指纹图谱包括中药材DNA指纹图谱和研究中的中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱。目前最常用的是中药色谱指纹图谱。
    目前,在国际上也提倡将指纹图谱技术用于草药产品的质量评价,如:美国FDA在草药产品工业指南中,要求申报 IND的植物药物质和植物药产品的资料中,采用指纹图谱作为质量控制部分的鉴别项;WHO在草药评价指南中,对有效成分不能鉴别的植物药制品和终产品,可提供特征成分或混合成分的色谱指纹图谱以保证产品质量的一致性;其他,如英国草药典、印度草药典、欧共体草药质量指南均将指纹图谱作为鉴别项,用以鉴别产品的真伪并评价质量的一致性。可见指纹图谱技术得到了国际的公认。目前指纹图谱研究和应用集中在中药注射剂、有效部位提取和单味药材的质控方面,也应用到中药的生产过程,正在发挥越来越重要的作用。


    4. 9化学模式识别
    化学模式识别是根据物质所含化学成分用计算机对其进行分类或描述。目前其方法主要有主成分分析(PCA)、简单分类计算法(SIMCA )、非线性映射(NLM)、星座图技术、模糊模式识别和人工神经网络(ANN)等。目前,在中药质量控制中应用较多的为人工神经网络。
随着科学技术的飞速发展,许多中药质量标准评价方法还会不断地完善和创新,如色谱技术、光谱技术、质谱技术、热分析技术、分子生物技术、电泳技术、扫描电镜技术、计算机图像分析技术、统计学多元分析技术以及示波极谱技术等。随着检测的科学性、准确性和灵敏性不断提高,以及仪器设备的普及,将使先进的检测方法更多的应用于法定标准中。
我国中药质量标准的设置,多年来一直依照和沿袭化学药物的质量控制模式,但随着中药事业的发展和中药现代化的进程,中药质量标准与整体的中医理论观念不相符,其局限性和缺陷逐渐显现。尽管目前的检测方式仍将在长时期内占据主流,但发展趋势将是多学科渗透,从单指标至综合多指标发展,如将化学图谱与相应的药理活性指标相结合,制备生物活性图谱,对药物的质量做整体评价,更好地保证用药安全与有效。

 

    [1]谢培山,中药质量控制模式的发展趋势.中药新药与临床药理,2001,12(3):188
    [2]钱忠直,齐平,王国荣,《中国药典》2005年版(一部)品种主要增修订情况.中国药品标准,2005,6(1):252
 

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